为当下的抗结核药物方案设计分子诊断

                                                                                                 结核帮 结核帮 2023-10-31 17:01 发表于北京

摘要

诊断研发必须同药物研发同步来保证新治疗药物能长期有效。近来，越来越多新型以及老药新用抗结核药物及其组成的新方案面世，但大量这类药物尚无快速、准确的分子诊断手段检测其敏感性。在卫生系统的各层级缺乏快速、有效的检测利奈唑胺、贝达喹啉、氯法齐明以及硝基咪唑类（普托马尼、德拉马尼）以及吡嗪酰胺药物敏感性试验（DST），让目前的抗结核药物方案（DS-TB和DR-TB）的有效性暴露于发生耐药的风险中。鉴于目前的世界卫生组织（WHO）结核病治疗指南建议以及一些极具潜质的新方案，为了更好的利用这些方案，本文罗列了一些关于检测新抗结核药物耐药初始以及后续检测（initial and follow-on test）的关键性诊断缺口。此外，本文还就那些有潜质被纳入检测目前方案中关键的新型和老药新用抗结核药物敏感性的快速分子、测序诊断的基因靶标谈了谈看法，并对现有检测技术开展耐药基因突变检测的可行性进行了评估。基于目前的认知，本文还为下一代分子检测提出了设计的重点领域，特别是这类检测要能为结核病患者制定合理、有效的方案起到可靠的参考作用。本文呼吁研发人员、机构将这类关键性的分子结核检测作为研发重点，并为测序技术的不断演化、推广以及实施给予支持，以夯实结核病耐药机制的证据基础，为更为快速的治疗决策提供可靠的循证依据，保护好目前方案中的关键药物，为实现终止结核病的目标添砖加瓦。

临床试验注册: ClinicalTrials.gov 编号: NCT05117788

随着越来越多的新型和老药新用抗结核药物被指南推荐，新型抗结核药物方案具有加快世卫组织（WHO）终止结核病策略（End TB strategy）各项目标实现的潜质。一般来说，这些新方案不仅安全，疗程更短，患者服药耐受性也更好，是结核病患者护理里程碑事件。然而，这些新方案要发挥其全部疗效还有赖于循证的临床决策，特别是在抗结核治疗开启前就关键性的药物开展耐药检测或排除。

为了保护这些新药的有效性，亟需研发能快速发现这些药物耐药的检测手段。然而，目前抗结核药物和诊断研发进程并不同步，且在新方案获准用于临床同组成该方案的新药临床耐药被首次发现之间常常有相当长的间隔，而新药物耐药检测的研发和生产只能尾随新方案药物临床耐药被发现之后。目前，许多新型抗结核药物尚没有经WHO推荐的快速分子耐药检测（表1）。鉴于目前抗结核新药广谱快速耐药检测的空白，临床只能依靠表型药敏试验（pDST）对这些新药和老药新用药物开展敏感性检测。即便能开展pDST，这类检测的结果也常常来得过晚，让绝大多数患者在没有耐药谱循证参考的情况下被给予经验化的药物方案治疗，而他们很可能已经对这些药物耐药。同时，文献已经报道了最为重要的抗结核新药发生耐药。这也是为什么，为了开展有效的患者管理，切实降低结核发病率，在卫生系统的各个层次大规模启用抗结核新药的同时必须伴随推广规范、快速、准确的耐药检测的应用（图1和2）。

鉴于此，作为科研领域的一个里程碑事件，于2021年发布的《WHO结核病耐药突变分类》（the 2021 WHO TB catalogue of mutations associated with drug resistance）对研发人员、机构就优先耐药遗传标志物以及相关突变同耐药表型的相关性给予了相应的指引。同时，通过微量滴定法开展的基于最小抑菌浓度（MIC）的DST继续为该领域增加有价值的证据。然而，我们对新药耐药可能的基因靶标同耐药相关临床表型的表达之间的关系的理解尚浅显，且截至目前开展的相关研究一般都会发现耐药基因同耐药表型之间的关联处于一种高度复杂的状态，再次说明研发耐药检测新方法的必要性。尽管，下一代测序技术（NGS）能覆盖不同且复杂的基因标志物来开展耐药“确诊”和/或“排除”诊断，但NGS检测的流程仍然高度复杂且需要中心检验设施方能开展。虽然无需培养的靶向NGS（tNGS）不需要像pDST那样在生物安全三级实验设施开展，不过其复杂的检测流程和对于操作人员专技水平的高门槛都让tNGS在实验室之外的应用非常有限，也就是说这种技术不能在床边（POC）为耐药结核病患者提供诊断服务。

鉴于我们对于重要抗结核药物分子耐药机制愈发广泛、深入的理解，参考目前的抗结核治疗方案，本文罗列了在卫生系统的各个层级检测临床相关耐药的关键技术缺口，探讨了如果抗结核新药耐药没有被及时发现，导致发生药物耐药和治疗失败的可能。此外，本文还就为像利奈唑胺、贝达喹啉、硝基咪唑类以及吡嗪酰胺这样的抗结核药物合理的设计分子DST提出了建议，这些建议涵盖了“确诊”和“排除”耐药检测以填补目前结核病病例发现、诊断的短板和空白。

迄今贝达喹啉在临床试验和结核病规划条件下都大大改善了DR-TB患者的治疗转归。2019年，WHO在其指南中有条件的推荐在治疗利福平耐药和耐多药结核病（MDR/RR-TB）的短程和长程化疗方案中启用贝达喹啉。最近，则将这一建议扩展到为MDR-TB患者开具的疗程6个月的BPaLM方案和为有证据显示氟喹诺酮类耐药的MDR-TB患者开具的BPaL方案中。值得注意的是，开展贝达喹啉DST也是为基层卫生服务中心研发的下一代分子DST的最基本诊断性能要求之一。此外，目前正在开展的评价像BPaMZ方案有效性、安全性这样含贝达喹啉方案的临床研究，很可能进一步的夯实贝达喹啉抗结核的证据基础为指南的进一步修订提供参考，进而改善结核病患者的治疗。

尽管贝达喹啉对多种不同药物方案的重要性不言自明，但在规划条件下推广这类方案一直以来都受到疗程和用药安全性的困扰，而这两个因素也是导致耐药发生的关键变量。贝达喹啉是一种半衰期很长的药物，在中断治疗后或同半衰期不匹配、不互补的药物联用时，让患者暴露于药物发生获得耐药的风险中。尽管目前贝达喹啉的耐药率尚低，在前期未服用过贝达喹啉的患者的分离株中还是报道了贝达喹啉MIC的上升，说明患者的分离株（特别对于一些特定的Mtb种系来说）可能发生了交叉耐药（氯法齐明耐药）和/或在某些地区贝达喹啉天然耐药株（原发耐药）可能已经在流行。对于那些接受贝达喹啉方案治疗前未能发现药物耐药的患者，抗结核治疗失败的风险是很高的，好比在ZeNix BPaL研究中，在基线发现贝达喹啉表型耐药的患者中3/9（33%）最后的治疗转归都不良。迄今，也只有pDST才能准确的检测贝达喹啉耐药。

在2021版《WHO耐药突变分类》中，尚没有任何目前发现的贝达喹啉（或氯法齐明）耐药相关突变达到了预设的两种药物耐药表型的关联信度等级标准，大多因为目前采集到的贝达喹啉耐药Mtb菌株数量还非常有限。突变分类的下一个版本会将新采集的贝达喹啉耐药菌株的遗传突变数据考虑进来，并将特定的耐药突变株（select variants）设置为经信度评价的贝达喹啉表型耐药标靶（markers）。目前文献中报道最多的贝达喹啉耐药基因突变是atpE和mmpR，让它们成为NAAT检测的重点标志物。就atpE基因而言，只有A63P突变具有可能的贝达喹啉耐药临床相关性。整体来看，atpE基因突变似乎仅仅同少量全球各地报告的表型贝达喹啉耐药有关。一个解释是atpE突变可能演化活性较低（lower fitness），所以在抗结核治疗期间容易被其他的突变淘汰，所以检出很少。相反，mmpR基因似乎是一个更为全球化的，同临床贝达喹啉表型耐药相关程度更高的标志物，因为大量的mmpR突变同贝达喹啉表型耐药以及不良的临床治疗转归有关。据一项近期开展的囊括了临床突变株遗传数据的综述研究，在核苷酸192-199之间发生的mmpR基因框移突变（frameshifts）以及在atpE基因发生的A63P/V突变似乎是报道最为频繁（多篇不同的文献）的同贝达喹啉表型耐药相关的基因突变。研发人员可以考虑将这些突变作为分子耐药检测的初始标志物，不过需要指出目前总的样本量还很少，且由于贝达喹啉耐药相关外排泵机制的影响（如暴露/激活），让这些突变同贝达喹啉耐药表型之间关联程度不同/不稳定。

鉴于在分子层面预测表型贝达喹啉耐药的复杂性，诊断研发人员、机构最好能将检测设计的重点放在能涵盖多个不同基因长片段的方法上，如一些能对全基因组进行扩增的线性探针和实时PCR检测技术路线，并随着特定的新的耐药基因信度等级的不断的提升，将它们陆续的纳入到其中。NGS方法特别适合开展这种广泛性、包容性的测序，且这种方法还能随着遗传标志物（耐药基因突变）相关性的增减在测序过程中显示或遮掩（display or conceal）特定的耐药基因突变。不过，对分子检测进行改进最终还是需要生成、参考更多、更新的耐药相关遗传数据来对检测的耐药诊断性能进行不间断的检讨以及满足不断修订的监管要求，能对“开放格式”的分子检测进行快速的改进，至少不需要再开展成本昂贵、耗时耗力的推倒重新设计，最终大幅缩短检测升级换代所需的诊断性能证据生成时间。此外，如果分子检测已经覆盖了特定的耐药基因突变，升级换代的目的仅在于是否需要保留或改进其耐药标志物调用机制（resistance calling mechanism）的话，可能仅需要参考现存的数据库来生成诊断性能数据就可以了。就上段文字提及的特定耐药基因突变，比方一款靶向NAAT检测如果已经涵盖了mmpR基因核苷酸192-199之间的突变以及atpE基因的A63P/V突变，可能目前就可以开展贝达喹啉耐药的“确诊”检测了，好比目前GeneXpert MTB/XDR开展乙硫异咽胺耐药检测的机制一样。尽管这类检测的总的诊断灵敏性还存在一定的缺陷，但采取上述设计策略的分子检测才有可能给予临床决策、方案设计有力的参考。

鉴于上文提及的贝达喹啉耐药确诊检测的相关制约，另外一个合适方法是通过筛查相关耐药突变的缺失、删除或发生框移形变情况来进行贝达喹啉耐药的“排除”诊断。不过鉴于目前atpE和mmpR基因突变在临床条件下发生率还较低，以这两种基因突变的缺失为“排除”耐药诊断的靶标，很可能带来很不错的阴性预测值（NPV），进而对抗结核治疗的临床决策产生重大的影响。目前已经有数款测序检测按照这种思路进行设计，且能有效的“排除”耐药，在适合于一线部署的NAATs检测问世之前，这种耐药“排除”分子检测是可以试着进行推广的。最终，还是需要进一步的在一个更大的分离株样本库中开展研究将突变体同贝达喹啉表型耐药pDST结果进行关联（WHO和其他的一些研究伙伴目前正在开展此类研究）以进一步的对贝达喹啉耐药分子检测的设计及其结果解读给予循证参考。

利奈唑胺是一种通过干扰MTBC蛋白合成起到抑菌活性的恶唑烷酮类抗生素。而利奈唑胺口服的特性让这种药物特别的适合纳入目前和未来的抗结核方案，让患者免于长期注射抗结核注射剂的严重毒副作用，其治疗转归也较含注射剂方案更加优秀。WHO强力推荐利奈唑胺作为“A组”抗结核药组成治疗MDR/RR-TB的长程化疗方案，并在最近修订的指南中推荐含利奈唑胺的6个月全口服BPaL和BPaLM方案治疗氟喹诺酮类耐药与否的MDR-TB患者（图1和2）。

鉴于目前利奈唑胺的最佳剂量以及疗程都还没有一个定论，所以临床Mtb菌株对于该药物产生耐药一直以来都是一个隐忧，特别是还要考虑到该药物相关的线粒体毒性，且有证据显示利奈唑胺耐药已经在规划层面呈上升趋势。由于发生治疗失败的患者中往往存在未发现的药物耐药情况，所以在抗结核治疗启动前开展DST检测是很关键的。2017年WHO牵头开展了关于在7H10、7H11以及MGIT液体培养基中开展利奈唑胺耐药检测绝对浓度的技术咨询，但目前尚没有任何一款在23S rRNA基因（rrl）或50S核糖体蛋白L3基因（rplC）中发现利奈唑胺耐药表型相关耐药基因突变的快速靠近POC分子检测问世。

最常见的利奈唑胺耐药相关突变是rplC C154R，这也是唯一达到《WHO耐药突变分类》“耐药突变相关性”信度等级的突变。关于rplC C154R变异株的体外实验显示在MGIT液体培养基中利奈唑胺MICs在4-8 mg/L，同MDR-TB临床分离株的MIC数据相符。其他的rplC基因突变（如T460C），连同一系列不同的rrl突变，包括体外的g2299t和g2814t突变株以及一个临床a2810c和g2814t双突变株，都发生了显著的利奈唑胺MIC上升。

目前，利奈唑胺有着适合开展分子检测最为清晰的标志物，因为绝大多数全球各地采集到的利奈唑胺耐药表型株都能同存在于2个基因上的特定的耐药突变“热点”关联。最终，任何能快速诊断利奈唑胺耐药的分子检测最起码应该将rplC C154R突变作为诊断标志物纳入进来。尽管这种突变的全球诊断灵敏性只有38.2%。不过，在利奈唑胺高暴露的rplC C154R突变株高流行地区，纳入这种突变靶标的分子检测预计将展现相当不错的真实世界诊断性能。为了进一步的提升分子利奈唑胺检测的灵敏性，rrl 2270-2299以及2746-2814基因域内的突变也可以被考虑纳入（补充）。

为了能最大程度的发挥分子检测的效能，研发方在设计新款利奈唑胺分子耐药检测时还需要考虑目前抗结核药物方案的情况。当利奈唑胺作为一种长程化疗方案的补充药物治疗MDR/RR-TB时，一种低检测成本的利奈唑胺耐药“确诊”检测对于早期提示临床医生患者发生利奈唑胺耐药是有好处的，这样他们就能尽早的决策是否需要纳入一种新药在长程方案中替代利奈唑胺。鉴于近来WHO指南推荐启用BPaL和BPaLM方案治疗MDR-TB，所以设计一款具备检测一线抗结核药物耐药性，还能检测氟喹诺酮类、贝达喹啉和或利奈唑胺耐药的分子快速检测对于为患者制定化疗方案是具有相当临床价值的。目前在抗结核治疗开启的时候临床医生还无从知晓许多这类药物的耐药情况（图1和2），他们需要等到抗结核治疗开始数周后才能获得pDST结果，并参考对原方案进行修订。不过，鉴于目前利奈唑胺在全球的耐药率尚低，研发一款“排除”检测在相关的基因上确认耐药相关突变的缺失也不失为一款有效的利奈唑胺耐药检测，至少在近几年，其结果可以在绝大多数地区指导药物方案的制定。理想情况下，研发人员应该参考自身技术的参数、优势，研发一系列“确诊”和“排除”检测，并对两类耐药检测的制约有深刻的理解，并基于这样的理解来规划这些耐药检测的临床应用场景（use case），包括当地的利奈唑胺耐药率，特定利奈唑胺耐药突变株的流行情况。

以德拉马尼和普托马尼为代表的的硝基咪唑类抗生素通过抑制分枝杆菌细胞壁蛋白的合成产生抗菌活性。德拉马尼已经被WHO推荐组成长程方案治疗MDR/RR-TB，迄今这类含DLM长程方案达成了相当不错的治疗转归。由全球抗结核药物研发联盟（TBA）研发的普托马尼则用于组成全口服的BPaL方案，近期也被WHO在其修订的指南模块中推荐治疗MDR-TB（图1和2）。

目前的证据指出硝基咪唑类耐药是值得关注的。相关的自发突变体研究指出硝基咪唑类耐药突变的发生频率同异烟肼、乙胺丁醇和吡嗪酰胺相当。相关研究还发现特定的耐药突变在未经药物暴露的情况下自然的发生，所以硝基咪唑类发生基线耐药是值得引起重视的。评价含德拉马尼MDR-TB方案的213临床试验发现德拉马尼方案组341例参试者中4例发生了德拉马尼耐药（1.2%），而安慰剂组的170例参试者中没有发生DLM耐药。作为相对较新推出的抗结核药物，尽管检测硝基咪唑类耐药的pDST和测序技术尚没有被大量的研发出来，且目前也没有检测这类药物耐药的快速分子检测，尝试将所有硝基咪唑类的分子耐药靶标发掘出来并对它们进行描述是非常有必要的。德拉马尼和普托马尼是两种需要通过F₄₂₀辅酶依赖性生物还原通路激活的前药（prodrugs），所以在F₄₂₀通路酶上发生任何的功能缺失突变（LoF），包括dnn（Rv3547），fbiA（Rv3621）以及fbiC（Rv1137）预计都会导致两种药物发生交叉耐药。然而，约10-17%的表型普托马尼耐药分离株在以上这些基因上并没有发生突变，说明还有其他的尚未被发现的普托马尼遗传耐药机制。此外，硝基咪唑类交叉耐药的程度还没有得以完全的揭示。

同时，在硝基咪唑类耐药突变发生频率和相关性方面还有许多未知。一般来说，硝基咪唑耐药基因突变多发生于ddn（12-29%）、fbiA（15-19%）和fbiC（25-55%），而fbiB和fgd基因发生突变的几率仅分别为2-4%和4-7%，尽管数据还非常有限。鉴于硝基咪唑耐药突变涵盖至少5个基因，包括许多插入和缺失（indels），让研发快速分子耐药诊断面临许多挑战。就经信度评级的突变而言，只有ddn L49P突变满足标准被临时认可为德拉马尼“相关耐药突变”，不过绝大多数该突变的数据来自于还没有被WHO认可的肉汤微稀释盘法。此外，这一突变在全球耐药分离株中的流行情况还不清楚。MIC研究数据显示硝基咪唑类耐药还同其他突变相关（如自然发生的ddn L107P和fbiA D49T突变），尽管这些突变的全球流行及其临床相关性尚不清楚。不过鉴于一款能侦测ddn L49P突变的分子检测在全球德拉马尼耐药分离株中的理论灵敏性仅为约6.1%，所以亟需对硝基咪唑类耐药遗传机制开展进一步的研究，包括不同菌株种系的影响，最终为相关耐药分子检测研发提供依据。

迄今，硝基咪唑类耐药相关基因区域都还没有明确的证据，更别提可以被硝基咪唑类耐药快速分子检测纳入为标志物的特定的耐药相关突变了。不过，在目前DR-TB药物方案的背景下，特别是BPaL/M方案在全球推广，研发一款初始或后续的（initial or follow-on）硝基咪唑类耐药分子检测的价值是毋庸置疑的。就像所有耐药遗传机制尚未定性的新型和老药新用抗结核药物一样，我们建议诊断研发企业考虑研发一款“排除”耐药检测，并最大程度上保持其检测设计的“开放性”（能基于不断更新的证据不断的更换耐药遗传标志物），如果能读取大片段的全基因就最好不过，因为这样就能通过参考相关药物耐药机制不断深入的理解和不断更新的证据来灵活的开展下游的解读分析，特别是避免了成本昂贵且耗时耗力的对检测进行推倒重新设计。不过在目前的空窗期，最起码可以对硝基咪唑类耐药已知的相关基因区域进行测序以确定是否有耐药突变的缺失来开展“排除”诊断。同时，作为一种可以用于定义硝基咪唑类遗传耐药机制、记录其耐药流行情况的科研、监测工具，对测序技术进行持续的投入也是非常关键的。

吡嗪酰胺是一种对顽固分枝杆菌有活性的烟酰胺类似物，这种药物可以同其他的一线抗结核药物、贝达喹啉和硝基咪唑类联用，并缩短抗结核药物方案的疗程（图1和2）。基于以上理由，吡嗪酰胺是组成治疗药物敏感结核病（DS-TB）和DR-TB药物方案的关键药物。由异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺组成的HRZE方案是世界卫生组织（WHO）推荐的治疗DS-TB的药物方案。同时，该药物不仅是WHO推荐治疗异烟肼单耐药结核病（mono Hr-TB）方案的构成药物，还是组成目前推荐的治疗MDR-TB长短程方案的补充药物（add-on drug）。目前，吡嗪酰胺还在临床研究中同贝达喹啉、普托马尼和莫西沙星一道组成了BPaMZ方案治疗难治MDR-TB，尽管现存证据尚不足以证明该方案的安全性、有效性。

鉴于吡嗪酰胺在抗结核药物方案中扮演的重要角色，所以患者开启抗结核治疗前对该药物的敏感性开展评价是很关键的。吡嗪酰胺耐药流行情况在全球都有很详尽的记载，基于不同的地理区域，在DS-TB患者中PZA耐药率在0-25%，MDR/RR-TB患者中这个比例为40-90%。尽管治疗DS-TB的HRZE方案开启前没有开展PZA DST，患者暴露于治疗失败的风险相当的低，但对于DR-TB患者而言，这个风险就很高了，一项在乌兹别克斯坦开展的研究显示90%的获得了不成功治疗转归的患者在短程抗MDR-TB方案开启前均漏诊了PZA的基线耐药。另一项来自加拿大魁北克的研究显示，比起感染完全敏感菌株的结核病患者，发生了PZA单耐药的患者临床治疗转归要差很多。尽管在DR-TB人群中PZA基线耐药率较高，目前PZA耐药检测的手段还非常有限，只有高度复杂的GenoScholar PZA-TB II（Nipro，日本）这一种检测获得了WHO有条件的推荐。此外，只有在MGIT液体培养基中开展的pDST才被推荐开展PZA耐药表型检测，不过其诊断性能也不稳定，且这种DST方法只能在更高层级的中心实验设施（参比实验室）开展。最终，由于以上提及的这些制约，许多患者都在没有开展PZA DST的情况下被给予了经验化的方案治疗。

PZA耐药相关突变主要是编码吡嗪酰胺酶的pncA基因上发生的各种突变。尽管pncA看似是一个分子检测理想的单一遗传标志物，这一基因的耐药机制非常的复杂。首先，耐药突变分布于长达561 bp的pncA基因上，且这些突变的引物都没有明晰的“热点”或耐药相关突变簇团（clusters）。值得关注的耐药突变包括缺失和插入（indels），甚至是全基因缺失（whole gene deletions）。同时，pncA基因上还有很多同耐药不相关的中性多态性突变。在《WHO耐药突变分类》中，在pncA基因上至少有105个多态性突变同耐药相关，且许多其他的突变还具有临时的耐药相关性（即由于耐药发生频率较低的那些不太明确耐药相关性的突变）。上述因素一直以来都是为基层医疗机构研发快速PZA NAATs检测并解读其结果的重大障碍。

尽管复杂的PZA遗传耐药机制为快速分子DST的研发带来了许多挑战，目前有两种方法还是很有前景的。首先是将所有已知的中性多态性突变作为靶标纳入到分子检测中，并将任何同野生型不同的变异体检测出来，就像Genoscholar PZA-TB II的设计一样。尽管在检测性能和结果解读方面面临许多操作上和技术上的困难，这种检测设计仍然是很有前景的。在临床条件下，这种分子检测设计处理培养分离株展现了81.2%的诊断灵敏性以及97.8%的特异性。实际上，《WHO耐药突变分类》为进一步改善PZA耐药检测性能对检测结果进行“专家判定”（expert rules）也给出了相应的定义和指导。然而，为了更好的启用这种分子方法来诊断PZA耐药，还是需要参考多专家的意见（collective input）才能更好的将临床相关的PZA耐药同pncA突变进行关联。

其他的方法还包括检测吡嗪酰胺酶活性的方法，如Bioneer AccuPower平台，这种方法被认为可以缩短PZA DST的耗时。然而，这类方法要么需要在开展比色法筛查前进行长达数天的培育，要么需要对pncA基因开展PCR扩增，并在一个无细胞小麦胚芽蛋白表达系统中合成吡嗪酰胺酶，并通过比色法来评价其产物的活性，这种方法不仅耗时，还需要很高的专技门槛且需要开展外部的质量评估。尽管这类方法还不能开展POC检测，但它们仍然在耐药发现以及将耐药突变同耐药表型进行关联方面扮演重要的角色，进而为下一代的PZA分子快速检测提供更多的耐药相关关键遗传标志物。

值得注意的是，在目前抗DR-TB药物方案的背景下（图1和2），研发一款快速的PZA耐药检测伴随现存的异烟肼和利福平DST开展耐药初筛，为异烟肼单耐药患者治疗决策提供依据（好比患者是否能入组REZLv方案治疗），或作为初始异烟肼、利福平DST的反射耐药检测（reflex assay）就患者是否适合纳入其他方案（如长短疗程的MDR-TB方案）提供依据是有其价值的。如贝达喹啉和硝基咪唑类一样，测序技术在临床分离株中开展PZA耐药检测仍然是优先选项，因为测序可以更好的应付pncA基因复杂的耐药遗传机制，可以发现完整的像中性多态性以及indels这样的核苷酸序列，还能为下游生物信息系统给出准确的临床耐药解读筛选出同耐药无关的突变。最差的情况下，NGS可以通过检测耐药基因突变的缺失来给出PZA耐药的“排除”诊断，还能就相关pncA突变的流行情况及其同PZA耐药的关联性夯实证据。

耐药突变涉及复杂的耐药机制，目前已知耐药突变以及耐药相关遗传标志物稀少的数量都进一步的让快速分子耐药检测的研发举步维艰，这也是为什么目前在研和在评价中的针对新型和老药新用抗结核药物的新型分子耐药检测数量非常少（表1）。测序是一种重要的诊断手段，我们可以启用这种方法来对长片段的耐药相关基因域进行核对，不过这种技术对于设施门槛很高，仅限于在中心实验室开展。尽管目前正在开展全球首个关于无培养tNGS诊断DR-TB的多国多中心临床研究，不过迄今这种技术也仅仅被WHO推荐开展DR-TB疫情监测。目前，在抗结核治疗开启前临床决策方案制定阶段，医生对于绝大多数的抗结核药物的耐药性（敏感性）是不得而知的。由于全球DS-TB和DR-TB负担主要影响医疗资源紧缺/拮据的地区/中低收入国家，所以能更为贴近床边、患者，互联互通性能更佳的分子检测才是未来研发的重点方向。同时，即便这些新药和方案能在以上提及的中低收入国家推广，但如果不能优化患者管理中的诊断及其路径的话，很可能这些新药和方案将不能达成其预期的抗结核规划影响。为了更好的保护这些新药和方案，研发适用于结核病高负担中低收入国家的利奈唑胺、贝达喹啉、硝基咪唑类和吡嗪酰胺耐药检测应该成为今后诊断研发和实施推广的重点。在这样的背景下，两类分子检测应该给予重点关注：（1）至少覆盖了已知耐药相关突变的靶标“确诊”耐药检测（rule-in），以及（2）同时覆盖了多个不同基因或能在不同基因间通过快速区分“野生型” vs“非野生型”的宽泛的耐药“排除”检测（broad range rule out）（表2），这种检测应该能在药物耐药流行率尚低的地区展现一个很高的阴性预测值。

因为分子结核检测通常通过检索单个或相对较小的基因域以诊断药物耐药（如Truenat MTB/RIF和GeneXpert MTB/RIF和Ultra），所以研发人员必须在纳入检测标志物时对于基因域和突变按照其耐药相关性有所取舍（补充材料）。就新型和老药新用抗结核药物而言，目前只有利奈唑胺有研发一款靶向“确诊”耐药分子检测的潜质，因为截至目前为止LZD绝大多数耐药相关遗传机制都得到了很好的描述。另外，覆盖了不同的多元化基因的NAATs检测可能不仅能对一种抗结核药物，甚至是同时对不同抗结核药物的敏感性进行检测，因为这类核酸扩增检测可以覆盖很广泛的耐药机制，理论上单次提取扩增就能达到相当高的诊断灵敏性（如在Molbio Truelab Quattro或Hain GT-Blot 48这样的多模块Truenat或LPA平台对多个不同的耐药基因域或靶标进行检测）。另外一个方向则需要对目前分子检测（如GeneXpert MTB/XDR）所囊括的耐药检测模块进行重新检讨（reimagine）。从现存的分子检测中拿掉抗结核注射剂检测模块可以挪出两个全新的耐药检测点位（two reporters），如果能进一步的拿掉那些全球耐药发生频率很低的靶标（如ahpC），就能进一步的释放出新的耐药检测点位，这样我们就能将三个主要的同利奈唑胺耐药相关的基因域纳入到现存的分子检测中。最终，尽管这类分子耐药检测带宽度仍然有限，替换耐药相关性更高的靶标后这类检测能通过检索耐药突变开展LZD耐药“确诊”检测，仍然能够为抗结核药物方案的制定提供有价值的参考。

对于像贝达喹啉、硝基咪唑类以及吡嗪酰胺这类抗结核药物，更倾向于研发一种能在突变种类多变的长片段复杂基因中检索标志物的“排除”耐药检测。然而，应该注意到目前能够通过扩增产物并检索整个基因域来进行吡嗪酰胺和贝达喹啉耐药诊断的分子检测（如Genoscholar PZA-TB II）受以下因素的制约，如其结果的可视化读取有困难，Indels的解读，异质性耐药的检测以及如何区别非耐药相关突变。尽管测序在解决目前市面上的“确诊”或“排除”分子耐药检测的一些制约方面有优势，但在全基因测序流程前需要进行培养这个步骤还是限制了这种技术在基层医疗机构部署的前景。尽管tNGS提升了测序技术在复杂遗传标志物中检测耐药的能力，且不需要在生物安全三级实验室中开展培养，但由于其高度复杂的检测流程以及为降低成本开展高通量检测的要求，这种技术目前还是仅限于在更高层级的实验设施（图2）开展。所以为了进一步的推广测序方法的应用，精简其检测流程将是未来研发的最重要方向之一。

无论哪种研发方案，研发人员都应该意识到高级别参比实验室和基层医疗机构对于检测技术的需求及其应用这些技术的资源能力不尽相同。特别需要指出，应该运用数据整合分析来适当的加快检测结果的报告速度，最终实现确诊-临床决策能在同一天完成，其检测成本也应该同检测药物的数量及其方案相关性（A/B/C类抗结核药物）相称，同时其诊断性能和运行特性都要满足WHO-FIND针对下一代DST和NGS耐药检测起草的《WHO-FIND目标产品目录》最低性能要求（minimum requirements of TPPs for nx-gen DST and NGS）。更为实际的角度，应该为基层医疗机构的工作人员设计操作复杂程度更低的分子检测，这种检测专技门槛务必降到最低，同时还要保证其处理的样本类型及其制备不会成为这种技术在基层推广应用的重大障碍。此外，这种新型分子检测的运行（供电、网络等）和部署摆放参数（大小、重量、温湿度等）都需要满足具体部署地点的需求。目前对于结核病预防性治疗（TPT）重视程度不断提升，让分子结核检测可以被扩展应用到TPT临床决策中来。

为了进一步加快为新型和老药新用抗结核药物研发耐药检测的进度，以下研究领域应该给予重点关注（表3）。首先，鉴于在此前开展的临床研究中这些药物的耐药发生率还较低，亟需建立一个更为强大的临床结核分离株样本库，以便更好的将耐药表型和基因型数据进行关联。日常开展pDST检测的参比实验室，以及那些参与到大型临床研究中（特别是结核病患者疗末随访研究）的中心检验机构，应该响应WHO发出的关于夯实结核病临床数据的公共呼吁，将它们在日常临床工作中和科研活动中采集到的样本和测序分离株贡献给公共的结核分离株样本库，不断增进人类对于抗结核药物耐药机制的集体认知，并允许研发人员、机构可以利用这些样本开展检测研发工作。对于临床转归数据的评价尤其如此。其次，来自国家级实施性研究以及疫情监测数据，特别是在推广抗结核新药新方案过程中采集到的相关数据，应该在整理核对后作为患者管理数据面向检测研发方开放。第三，须立即对DST的微量滴定法开展验证，并在DR-TB疫情监测项目中推广全基因组测序（WGS），这样做有助于揭示关于新型抗结核药物的耐药的表型-基因型关联以及耐药相关突变发生的频率。最后，分子耐药检测的研发过程中，亦或是开展任何以揭示耐药机制为目的的研究，不仅需要关注药物耐药表型和基因型的二元数据，还需要关注等位基因交换以及酶活性试验数据，将遗传上位现象以及不同MTBC种系对于药物耐受带来的影响考虑进来，以更好的诠释边界耐药突变以及宿主相关因素扮演的角色（如NAT-2多态性突变），只有这样才能在抗结核治疗期间为标定、调整用药剂量提供更为客观的依据。以上这些研究方向加上目前为进一步补充耐药突变分类正在开展的研究，预计将为新型抗结核药物带来更为客观可靠的数据，强化相关突变同耐药表型的关联，最终为新型分子诊断技术的研发提供可靠的依据。我们再次建议目前的分子耐药检测研发侧重于满足在资源拮据的基层部署的要求。只有满足了以上提及的设计、研发和实施考量，为新型抗结核药物研发的快速分子耐药检测才能真正的发挥其效能，在卫生系统的各个层级扮演不同的角色。

尽管目前已经发表了大量的来自疫情监测或其他研究的MTBC遗传耐药数据，我们对于新型和老药新用抗结核药物耐药相关突变的认知仍然是很欠缺的。迄今，这些药物中只有利奈唑胺具备研发快速分子耐药“确诊”检测的清晰的遗传标志物，不过即便是这种药物也还有许多其他的耐药机制没有得以揭示。对于贝达喹啉和硝基咪唑类，这两种药物的遗传耐药机制则复杂得多，涉及数个大型基因内藏匿的耐药突变以及中性多态性突变。就吡嗪酰胺来说，尽管该药物耐药大多同一个单一基因上的突变相关，不过检测这种药物耐药关键的挑战不仅在于如何覆盖整个基因及其引物，更在于如何区分特定的耐药突变、Indels以及非耐药相关多态性突变。随着大型测序研究和启用微量滴定法DST的临床研究发表更多的相关数据，针对新型和老药新用抗结核药物研发的分子耐药检测的关键遗传标志物将愈发的明晰。与此同时，在绝大多数结核病患者首次就医的基层医疗机构，需要部署将所有已知中性多态性作为标志物的分子耐药检测，并就所有其他变体同野生型MTBC进行区分开展“排除”耐药检测来快速的为抗结核药物方案的制定提供客观的依据。同样，在不断夯实新型和老药新用抗结核药物遗传耐药机制相关证据基础的同时，在条件允许的情况下应该启用测序技术开展类似的“排除”耐药检测，为临床治疗决策提供依据。最后，新型冠状病毒肺炎大流行（COVID-19）让全球许多地区开展测序检测的能力大幅提升，而结核应该利用这一契机在医疗卫生系统的中基层推广tNGS技术开展DR-TB诊断。